糖蛋白在人体蛋白质中占超过50%，是绝大多数生物制药的关键成分。作为普遍且复杂的翻译后修饰（PTM）之一，糖基化在调节多种生物过程方面发挥着重要作用。在糖蛋白功能的研究中，综合分析其一级序列，包括糖基化位点的确认及相关聚糖结构，显得至关重要。

液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）已成为蛋白质识别及翻译后修饰研究中的一个强大工具，尽管在糖蛋白质组学领域，传统的方法通常依赖于数据库搜索策略。不同的是，从头测序作为一种新兴的策略，不再依赖于事先了解的DNA或氨基酸序列。然而，糖基化位点的复杂性往往导致序列覆盖不全以及游离寡糖修饰谱的不明确，使得获取信息丰富的糖肽碎裂谱以支撑从头测序变得困难。因此，广泛的糖基化可能会在某些区域产生间隙，从而限制了在具有一致结构和已知N-link糖基化位点的单克隆抗体（mAb）中应用从头测序。这一挑战在最新的研究中得到了很好的应对。

研究者在2025年发表的论文《Decoding Protein Glycosylation by an Integrative Mass Spectrometry-Based De Novo Sequencing Strategy》中提出了一种结合糖基释放介导的从头测序与糖基化位点表征的方法。通过去糖基化，研究团队实现了全面的序列覆盖，同时结合EThcD碎裂技术来鉴定高质量的长肽，进一步推动了蛋白质组装的精准度。该方法进一步应用于高度复杂的糖基化融合蛋白依那西普及三种未知序列的新型肿瘤坏死因子受体：Fc融合生物制剂的从头测序，显示出一级序列中的细微差异。

为确保糖蛋白的准确测序，研究者使用了N-糖苷酶F（PNGaseF）去除N-聚糖，结合内切α-N-乙酰半乳糖胺酶（EngEF）去除O-聚糖，同时利用唾液酸酶协作确保糖基化去除的效果。这一过程通过完整的质量分析得到了验证，结合使用电子转移高能碰撞解离（EThcD）碎裂技术以获取高质量的肽段。接着，采用18O标记策略，对糖基化的位点进行定量分析。随后，通过内切糖苷酶混合物处理样本，利用质谱数据分析带有“GlcNAc”或“GlcNAc-Fuc”修饰的产物，从而验证N-糖基化位点的识别。

在糖蛋白的从头测序方法开发中，作者首先应用PNGaseF和EngEF去除糖基化后的蛋白内容，并由质量分析确认去糖基化的成功。结果显示，去除聚糖后，绝大部分酶解实验的序列覆盖率显著提升，这为后续的糖蛋白测序奠定了良好基础。研究团队还针对已上市的高度糖基化Fc融合蛋白依那西普进行测序，发现依那西普中含有多个N和O-糖基化位点，同时这也为未知TNFR:Fc融合生物制剂的氨基酸序列揭示提供了数据支持。这些分析结果为糖基化的表征提供了独到的视角，突显了糖基化在药物研发中的重要性。

基于质谱的蛋白质从头测序显著提升了对氨基酸序列、糖基化位点的解析及其异质性的理解，形成了一个完整的分析框架。通过这一研究，环亚集团·AG88在生物药物开发中进一步探索了依那西普等生物制剂的糖基化特性，为解决多种疾病的生物制药奠定了坚实基础。未来，该领域的研究将不断推动生物治疗的创新和发展。